BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Asam nukleat merupakan salah satu
makromolekul yang memegang peranan sangat penting dalam kehidupan
organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. DNA atau DeoxyriboNucleic
Acid merupakan asam nukleat yang menyimpan semua informasi tentang
genetika. DNA inilah yang menentukan jenis rambut, warna kulit dan sifat-sifat
khusus dari manusia. DNA ini akan menjadi cetak biru (blue print) ciri
khas manusia yang dapat diturunkan kepada generasi selanjutnya. Sehingga dalam
tubuh seorang anak komposisi DNA nya sama dengan tipe DNA yang diturunkan dari
orang tuanya.
Asam nukleat sering dinamakan juga
polinukleotida karena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai
monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur yang terdiri atas gugus fosfat,
gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa nukleotida (basa N). Ada dua macam
asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA)
dan asam ribonukleat atau ribonucleic acid (RNA). Dilihat dari strukturnya,
perbedaan di antara kedua macam asam nukleat ini terutama terletak pada
komponen gula pentosanya. Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan
pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C nomor
2’ sehingga dinamakan gula 2’-deoksiribosa Perbedaan struktur lainnya antara
DNA dan RNA adalah pada basa N-nya. Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA,
mempunyai struktur berupa cincin aromatic heterosiklik (mengandung C dan N) dan
dapat dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin
mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai
satu cincin (monosiklik). Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin (A)
dan guanin (G). Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara DNA dan RNA.
Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T), pada RNA
tidak ada timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U). Timin berbeda dengan
urasil hanya karena adanya gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin dapat
juga dikatakan sebagai 5-metilurasil.
Di antara ketiga komponen monomer
asam nukleat tersebut di atas, hanya basa N lah yang memungkinkan terjadinya
variasi. Pada kenyataannya memang urutan (sekuens) basa N pada suatu molekul
asam nukleat merupakan penentu bagi spesifisitasnya. Dengan perkataan lain,
identifikasi asam nukleat dilakukan berdasarkan atas urutan basa N-nya sehingga
secara skema kita bisa menggambarkan suatu molekul asam nukleat hanya dengan
menuliskan urutan basanya saja.
Untuk mengetahui informasi genetik
yang terdapat dalam DNA digunakan teknik DNA Sequencing, yaitu metode
yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida (adenine, guanine,
cytosine dan thymine) pada molekul DNA. Saat ini teknik DNA
Sequencing sudah memasuki tahap baru yang mengarah pada large scale atau
high-throughput sequencing, jutaan bahkan miliaran basa nukleotida DNA
dapat ditentukan urutannya dalam sekali putaran saja.
1.2. Permasalahan
Terkait dengan persoalan tersebut diatas, maka yang
akan dibahas dalam kajian ini adalah:
1. Apakah pengertian sekuensing ?
2. Bagaimana prinsip dasar sekuensing?
3. Bagaimanakah metode sekuensing?
1.3. Tujuan Penulisan
1. Untuk mengetahui pengertian sekuensing
2. Untuk mengetahui prinsip dasar sekuensing
3. Untuk mengetahui metode sekuensing
BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian Sequencing
Sequencing adalah penentuan
urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek . Pengurutan
( sequencing ) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari
molekul DNA.
B. Prinsip Dasar DNA
Sequencing
DNA sequencing menggunakan metode
PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan
ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template)
untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip
dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini
dinamakan cycle sequencing.
Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa
adalah:
- Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua
(sepasang) seperti PCR
- ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs
dengan menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.
Saat proses ekstensi, enzim
polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan
menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Jika yang
menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena
ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus
5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.
Pada akhir cycle sequencing,
yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika
fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan
terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.
C. Metode Sekuensing
Ada dua metode yang dapat digunakan
untuk mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger.
Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang
bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari
fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam
nukleat molekul DNA yang diperiksa. Tekhnik yang digunakan adalah gel-gel
poliakrilamid pendenaturasi (denaturing
polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA
dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat
memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel
pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam
keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi
mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut
mendorong terjadinya pemisahan kedua untai molekul DNA.
1. Metode Maxam-Gilbert
Metode Maxam-Gilbert merupakan
metode yang didasarkan atas pemotongan DNA didaerah spesifik oleh zat-zat
kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang digunakan .
2. Metode Sanger.
Metode yang pertama kali
dikembangkan oleh Frederick
Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle
sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi
yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk
setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah
ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing
selesai, keempat hasil reaksi tersebut dirunning pada gel electrophoresis
sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat
ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling
bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang
digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan
primer yang dilabel melainkan dNTP.
a. Dye Primers dengan
Label Berbeda
Agar proses pemisahan fragmen pada gel
electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja, digunakanlah pelabel
fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing
Dengan teknik ini visualisasi dan
penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi
dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda
b. Dye-Terminators
Sequencing
Para ilmuwan menemukan cara yang
lebih simple untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda
untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing
dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan diputar pada satu lajur gel
electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.
Dalam metode Sanger, sintesis DNA
secara enzimatik terjadi melalui pembentukan secara berurut ikatan fosfodiester
antara gugus fosfat ujung 5’ bebas dari nukleotida baru dengan gugus OH dari
ujung 3’ rantai yang sedang memanjang . proses ini berlangsung sepanjang
molekul DNA. Dideoksinukleotida tidak mempunyai gugus OH pada ujung 3’nya,
melainkan gugus H. adanya dideoksinukleotida menyebabkan sintesis DNA terhenti,
karena ikatan difosfat tidak terbentuk. Pemanjangan rantai kan terhenti pada
titik ini dan basa terakhir diujung 3’ rantainya dalah sebuah terminator
dideoksi. Modifikasi dari metode sanger ini disebut dideoxy termination
sequencing
Dalam metode pengurutan Sanger,
digunakan empat campuran reaksi dalam pengurutan fragmen DNA. Tiap campuran
reaksi mengandung molekul DNA cetakan yang akan diurutkan, primer yang telah
diberi label dengan radioaktif, keempat macam deoksinukleotida. DNA polymerase
dan empat terminator dideoksi (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP). Jika salah
satu dari terminator ini digunakan pada untai DNA yang baru terbentuk, maka
sintesis untai baru ini akan terhenti; hasilnya adalah semua untai dengan
panjang yang bervariasi pada campuran reaksi akan berakhir dengan basa yang
sama. Produk-produk radioaktif tersebut akan dipisahkan dengan elektroforesis
dan divisualisasikan melalui autoradiografi. Hasil autoradiografi dibaca dari
bawah gel (fragmen terpendek yang berhenti paling dekat dengan ujung 5’) kearah
atas untuk mengetahui sekuens basa komplementer dari untai cetakan.
Berikut rangkuman metode Frederick
Sanger
- Primer bersama-sama dengan DNA polimerase dan
nukleotida ditambahkan ke sampel. Melanjutkan langkah-langkah yang sama ke
Proses PCR ke fase ekstensi
- Sampel dibagi menjadi empat kelompok.
- The novalty dari metode ini melibatkan molekul yang disebut
dideoksinukleosida trifosfat
(ddNTP), yang mirip dengan nukleotida normal kecuali bahwa atom oksigen
hilang dalam 3 ‘spot dari deoksiribosa. Mereka ditetapkan
sebagai ddTTP, ddATP, ddCTP, dan masing-masing sesuai ddGTP ke T, A, C, dan G.
Tidak adanya atom oksigen berakhir ekstensi primer reaksi ketika nukleotida
normal digantikan oleh ddNTP. Selain itu, masing-masing ddNTP neon memancarkan
sinyal yang berbeda untuk mengidentifikasi T, A, C, G basa.
4. Sampel diproses oleh
elektroforesis gel seperti biasa mengungkap urutan
DNA komplementer label pada
akhir dari setiap fragmen seperti ditunjukkan pada gambar diatas.
BAB III
PENUTUP
Berdasarakan penjelasan yang dikemukakan sebelumnya,
maka dapat di kemukakan beberapa simpulan diantaranya:
1.
Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang
relatif pendek yang memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari molekul DNA.
2. Komponen-komponen
yang terlibat dalam proses squencing meliputi:
- Beberapa kopi dari template DNA utas tunggal
- Primer yang sesuai (sepotong DNA yang dapat
berpasangan dengan DNA template yang bertindak sebagai titik mulai untuk
replikasi)
- DNA polymerase (suatu enzim yang meng-kopi DNA, menambahkan
nukleotid baru pada ujung 3’ dari template)
- Suatu ‘kolam’ berisi nukleotida normal
- Sejumlah kecil dideoksinukleotida terlabel
(radioaktif atau dengan pewarna fluoresent
3. Ada
dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA yaitu Metode
Maxam-Gilbert dan metode Sanger.
4.
Hasil dari skuencing adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang
satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen
tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul
DNA yang diperiksa.
5. DNA
Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini bisa dikembangkan
untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide
Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP
(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) untuk mengetahui apakah
individu tersebut membawa varian tertentu dari satu gen atau mengetahui adanya
mutasi dan aplikasi lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, Reece, Mitchel. 2002. Biologi Terjemahan
edisi kelima jilid 1. Jakarta. Erlangga
Triwibowo Yuwono. 2005. Biologi Molekuler.
Jakarta. Erlangga
