Bicara tentang analisa kimia, salah satu hal
yang sedikit merepotkan bagi saya adalah buffer. Buffer atau larutan
penyangga adalah larutan yang terdiri dari asam lemah dan garam-nya yang
dapat mempertahankan dan menjaga pH. Bidang bioteknologi tidak bisa
dipisahkan dari penggunaan larutan ini.
Kebutuhan
buffer kadang menyulitkan karena hampir setiap analisa membutuhkan
kondisi pH tertentu yang relatif stabil. Karena banyaknya macam dan
jenis buffer, pemilihan buffer yang akan digunakan menjadi masalah
tersendiri.
Dalam memilih buffer, yang harus
diperhatikan adalah pH optimum serta sifat-sifat biologisnya. Banyak
jenis buffer yang mempunyai impact terhadap sistem biologis, aktivitas
enzim, substrate, atau kofaktor.
Sebagai
contoh buffer phosphat akan menghambat aktivitas dari beberapa metabolik
enzim termasuk karboksilase, fumarase, dan phosphoglucomutase.
Barbiturate menghambat phophorilasi oksidatif. Tris buffer bereaksi
dengan amin primer dan memodifikasi transport elektron dan phosphorilasi
pada kloroplast. Tris juga menghambat enzim respirasi di mitokondria.
Dan masih banyak efek lain yang diberikan buffer. Oleh karena itu
pemilihan buffer terkadang menjadi kesulitan yang cukup merepotkan. Oleh
karena itu, gunakan konsentrasi buffer serendah mungkin yang masih
dapat untuk memaintain pH.
Berikut beberapa macam buffer yang kerap digunakan:
A. GLYCINE–HCL; PH 2.2–3.6, PKA = 2.35
Campur 25 ml 0.2 M glycine dan x ml HCl, kemudian encerkan hingga 100 ml dengan air suling.
x (ml)
|
pH
|
22.0
|
2.2
|
16.2
|
2.4
|
12.1
|
2.6
|
8.4
|
2.8
|
5.7
|
3.0
|
4.1
|
3.2
|
3.2
|
3.4
|
2.5
|
3.6
|
B. SODIUM ACETATE; PH 3.6–5.6, PKA = 4.76
Mencampurkan 0.1N acetic acid dan 0.1N sodium acetate untuk mencapai pH tertentu.
acetic acid
(ml)
|
sodium acetate (ml)
|
pH
|
185
|
15
|
3.6
|
176
|
24
|
3.8
|
164
|
36
|
4.0
|
147
|
53
|
4.2
|
126
|
74
|
4.4
|
102
|
98
|
4.6
|
80
|
120
|
4.8
|
59
|
141
|
5.0
|
42
|
158
|
5.2
|
29
|
171
|
5.4
|
19
|
181
|
5.6
|
C. BUFFERED SALINE (PBS, TBS, TNT, PBT)
Larutan buffer saline sering digunakan ketika melakukan eksperiment yang berhubungan dengan immunolocalization. Ada beberapa variasi dari buffer ini, tiga diantaranya sebagai berikut.
PBS 20x stock
|
TBS
| ||
Potassium chloride
|
4 g
|
53.6 mM
|
Potassium chloride 4 g
|
NaCl
|
160 g
|
274 mM
|
NaCl 160 g
|
Potassium phosphate monobasic
|
4 g
|
29.4 mM
|
Tris buffer (10 mM, pH 7.5) to 1 liter
|
Sodium phosphate dibasic (7•H2O) DI
|
43.2 g
|
17.5 mM to 1 liter
|
Use TBS when performing immunocytochemical
|
experiments on phosphate-sensitive tissues
| |||
(photosynthetic tissues typically)
| |||
TNT
|
PBT
| ||
NaCl
|
150 mM
|
PBS to vol
| |
Tris buffer (100 mM, pH 7.5)
|
to 1 liter
|
Tween 20 1% (v/v)
|
D. CACODYLATE BUFFER; PH 5.0–7.4, PKA = 6.27
Sodium
cacodylate buffer [Na(CH3)2 AsO2 • 3H2O] adalah alternatif dari
Sørensen’s phosphate buffer. Mempunyai kapasitas buffer yang baik pada
range pH 5.0–7.4. Cacodylate digunakan untuk aplikasi mikroskop elektron
sebagai metode untuk menghindari penambahan phosphate saat sample
preparasi. Mitochondria dan arganela lainnya dapat rusak jika terkena
konsentrasi phosphate berlebih yang terdapat dalam Sørensen’s buffers.
Siapkan
0.2 M sodium cacodylate stock solution dalam air (4.28 g/100 ml).
Tambahkan x ml 0.2 N HCL per 100 ml cacodylate stock solution, diikuti
denga penambahan air demin sampai volume 400 ml hingga diperoleh 0.05 M
cacodylate buffer pada pH yang diinginkan.
0.2 M HCl
|
pH
|
94.0
|
5.0
|
90.0
|
5.2
|
86.0
|
5.4
|
78.4
|
5.6
|
69.6
|
5.8
|
59.2
|
6.0
|
47.6
|
6.2
|
36.6
|
6.4
|
26.6
|
6.6
|
18.6
|
6.8
|
12.6
|
7.0
|
8.4
|
7.2
|
5.4
|
7.4
|
E. CITRATE BUFFER; PH 3.0–6.2, PKA = 6.40
Citrate buffer stock solutions: A: 0.1 M citric acid; B: 0.1 M sodium citrate. Campurkan kedua larutan dengan perbandingan volume dan encerkan dengan air sampai 100 ml untuk membuat pH yang diinginkan.
0.1 M citric acid
|
0.1 M sodium citrate
|
pH
|
46.5
|
3.5
|
3.0
|
43.7
|
6.3
|
3.2
|
40.0
|
10.0
|
3.4
|
37.0
|
13.0
|
3.6
|
35.0
|
15.0
|
3.8
|
33.0
|
17.0
|
4.0
|
31.5
|
18.5
|
4.2
|
28.0
|
22.0
|
4.4
|
25.5
|
24.5
|
4.6
|
23.0
|
27.0
|
4.8
|
20.5
|
29.5
|
5.0
|
18.0
|
32.0
|
5.2
|
16.0
|
34.0
|
5.4
|
13.7
|
36.3
|
5.6
|
11.8
|
38.2
|
5.8
|
9.5
|
41.5
|
6.0
|
7.2
|
42.8
|
6.2
|
F. SØRENSEN’S PHOSPHATE BUFFER; PH 5.8–8.0, PKA = 7.20
Campur
sejumlah tertentu stock solution dan tambahkan air suling untuk
mendapatkan 100 ml larutan Sørensen’s phosphate buffer 0.1 M. Ingat,
konsentrasi phosphate yang tinnggi dapat bersifat toksik bagi sel
tanaman.
Stock solutions:
A 0.2 M NaH2PO4
B 0.2 M Na2HPO4
B 0.2 M Na2HPO4
A (ml)
|
B (ml)
|
pH
|
92.0
|
8.0
|
5.8
|
87.7
|
12.3
|
6.0
|
81.5
|
18.5
|
6.2
|
68.5
|
31.5
|
6.5
|
62.5
|
37.5
|
6.6
|
56.5
|
43.5
|
6.7
|
51.0
|
49.0
|
6.8
|
45.0
|
55.0
|
6.9
|
39.0
|
61.0
|
7.0
|
33.0
|
67.0
|
7.1
|
28.0
|
72.0
|
7.2
|
23.0
|
77.0
|
7.3
|
19.0
|
81.0
|
7.4
|
16.0
|
84.0
|
7.5
|
8.5
|
91.5
|
7.8
|
5.3
|
94.7
|
8.0
|
G. PHOSPHATE–CITRATE BUFFER; PH 2.2–8.0, PKA = 7.20/6.40
Untuk membuat 100 ml larutan buffer phosphat-citrate.
Stock solutions:
0.2 M dibasic sodium phosphate
0.1 M citric acid
0.1 M citric acid
0.2 M Na2HPO4 (ml)
|
0.1 M citrate (ml)
|
pH
|
5.4
|
44.6
|
2.6
|
7.8
|
42.2
|
2.8
|
10.2
|
39.8
|
3.0
|
12.3
|
37.7
|
3.2
|
14.1
|
35.9
|
3.4
|
16.1
|
33.9
|
3.6
|
17.7
|
32.3
|
3.8
|
19.3
|
30.7
|
4.0
|
20.6
|
29.4
|
4.2
|
22.2
|
27.8
|
4.4
|
23.3
|
26.7
|
4.6
|
24.8
|
25.2
|
4.8
|
25.7
|
24.3
|
5.0
|
26.7
|
23.3
|
5.2
|
27.8
|
22.2
|
5.4
|
29.0
|
21.0
|
5.6
|
30.3
|
19.7
|
5.8
|
32.1
|
17.9
|
6.0
|
33.1
|
16.9
|
6.2
|
34.6
|
15.4
|
6.4
|
36.4
|
13.6
|
6.6
|
40.9
|
9.1
|
6.8
|
43.6
|
6.5
|
7.0
|
H. BARBITAL BUFFER; PH 6.8–9.2, PKA = 7.98
Untuk membuat 200 ml larutan buffer. Kedalam 50 ml Sodium barbital 0.2 M, tambahkan x ml 0.2 M HCl. Tambahkan air suling hingga volume 200 ml.
0.2 M HCl (x ml)
|
pH
|
1.5
|
9.2
|
2.5
|
9.0
|
4.0
|
8.8
|
6.0
|
8.6
|
9.0
|
8.4
|
12.7
|
8.2
|
17.5
|
8.0
|
22.5
|
7.8
|
27.5
|
7.6
|
32.5
|
7.4
|
39.0
|
7.2
|
43.0
|
7.0
|
45.0
|
6.8
|
I. TRIS BUFFERS
Solution
|
Preparation
| |
Tris, 1 M stock
|
Tris base DI Dissolve and adjust pH with the following approximate amount of HCl: pH 7.4 pH 7.6 pH 8.0
|
121.1 g 800 ml;
70 ml, 60 ml, 42 ml
|
EDTA, 0.5 M
|
Disodium ethylene diamine tetraacetate Adjust pH to approx. 8.0 and stir until dissolved
|
186.1 g
|
SSC, 20x
|
NaCl NaCitrate DI Adjust pH to 7.0 with NaOH then add DI to 1 liter
|
175.3 g 88.2 g 800 ml
|
SSPE, 20x
|
NaCl NaH2PO4 • H2O EDTA DI Adjust pH to 7.4 with NaOH then add DI to 1 liter
|
174 g 27.6 g 7.4 g 800 ml
|
TE
|
Tris EDTA Adjust pH using Tris stock solution
|
10 mM 1 mM
|
STE (TNE)
|
Tris NaCl EDTA Adjust pH to 8.0 using Tris stock solution
|
10 mM 100 mM 1 mM
|
Stock solutions:
0.2 M glycine
0.2 M NaOH
0.2 M NaOH
Campur 25 ml glycine stock solution dengan x ml 0.2 M NaOH dan encerkan dengan air suling hingga volume 100 ml.
x ml 0.2 M NaOH
|
pH
|
2.0
|
8.6
|
3.0
|
8.8
|
4.4
|
9.0
|
6.0
|
9.2
|
8.4
|
9.4
|
11.2
|
9.6
|
13.6
|
9.8
|
19.3
|
10.4
|
22.75
|
10.6
|
Demikian beberapa buffer yang bisa dijadikan pilihan untuk digunakan. Perlu diingat, bahwa larutan buffer hanya berfungsi untuk mempertahankan pH. Tidak berarti bahwa pH tidak akan berubah. Perubahan dan gangguan yang cukup besar dalam sistem dapat merubah pH meskipun telah ditambahkan buffer ke dalamnya.
Hal ini karena buffer
hanya menjaga agar pH tidak terlalu berubah signifikan dengan adanya
sedikit perubahan konsentrasi ion hidrogen dalam sistem.
0 comments:
Posting Komentar