Go Lets Do It

Nggolet duit

Read More

Makalah BIOTEK tentang M-BIO

BAB I
PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang
Teknologi M-Bio adalah Pembuatan pupuk organik dengan mengaplikasikan teknologi "polybag". Teknologi ini ditemukan oleh Prof. Dr. Rudi Priyadi, sejak 1996 lalu. Temuan itu melalui proses panjang, mulai dari uji lab hingga uji lapangan beberapa kali.
           Pembuatan teknologi ini sedikit berbeda dengan pembuatan kompos yang biasanya memakan waktu dua bulan. Pupuk ini hanya membutuhkan waktu seminggu. Caranya, hanya membuat pupuk organik dengan cara fermentasi (porasi) dengan aplikasi teknologi "polybag". Porasi ini, dibuat dari sampah, jerami, kotoran hewan, dan hijau-hijauan daun. Semua bahan difermentasi oleh mikroba, mikroorganisme tertentu, dalam hal ini digunakan mikroba dari kultur "polybag" selama seminggu. Mikroba yang terdapat dalam "polybag", yaitu Lactobacillus sp, selubizing phosphate bacteria, yeast, dan azosprillium.
           Mikroba itu, mampu memfermentasikan bahan organik dalam waktu cepat dan menghasilkan senyawa organik, seperti protein, gula, asam laktat, asam amino, alkohol, dan vitamin. Contoh produk terkenal yang dihasilkan proses semacam itu, seperti dalam makanan yang difermentasikan, yaitu tauco dari kedelai, saus kedelai, dan lainnya. Porasi yang dihasilkan bisa padat dan juga cair.

B.    Rumusan Masalah
-    Bagaimana cara pemakaian M-BIO?
-    Apa saja keunggulan M-BIO dibanding yang lain?
-    Peranan dan Fungsi Mikroba M-BIO
-    Di bidang apa saja M-BIO dapat diterapkan?

C.    Tujuan
-    Mengenal dan mengetahui teknologi M-BIO dalam penerapan ilmu bioteknologi.
-    Mampu menerapkan teknologi M-BIO
-    Mengetahui keunggulan M-BIO

BAB II
PEMBAHASAN

A.    Cara Penggunaan Teknologi M-BIO
a.    Kumpulkan bahan organik (kotoran ternak, rumput-rumputan, sisa-sisa panen dll) lalu dicacah.
b.    Siapkan air dalam wadah/ drum/ ember dll, kemudian tuangkan larutan M-BIO 15 ml / 1L air, kemudian diaduk.
c.    Masukkan bahan organik tadi sampai terendam, kira-kira volume bahan organik 1/3 volume air.
d.    Tutup wadah tersebut, dan tiap hari diaduk.
e.    Setelah 14 hari, larutannya siap disiramkan ke tanah, dengan ditambah air biasa 1 : 2.  (1 liter larutan PORASI CAIR + 2 liter air biasa).
Untuk membuat pupuk organik berkualitas (PORASI = Pupuk organik hasil fermentasi M-BIO) disebut PORASI PADAT.
a.    Kumpulkan bahan organik (kotoran ayam, kambing, sapi, sisa-sisa tumbuhan, jerami dll).
b.    Bahan organik tersebut dicacah / dihaluskan.
c.    Siramkan larutan M-BIO (15 ml M-BIO/1 L air) ke bahan organik tersebut secara merata sambil diaduk-aduk, sampai basah kadar air ± 50%.
d.    Tutup bahan organik tersebut, bisa dengan karung goni atau penutup lainnya.
e.    Setiap hari dibolak-balik agar suhu tidak terlalu tinggi, usahakan suhu dijaga jangan melebihi 45 derajat C.
f.    Setelah 12-14 hari, PORASI siap diaplikasikan ke pertanaman.
g.    Cara aplikasi PORASI, sama dengan aplikasi pupuk organik biasa.

Catatan :
Dosis PORASI untuk tanaman rata-rata berkisar antara 5 ton sampai 15 ton/ha, terutama tergantung kesuburan tanah dan komoditas tanamannya Membuat PORASI 1 ton diperlukan 1-2 L M-BIO
Selain itu, dalam bentuk cair adalah dedaunan hijau, dimasukkan dalam air dalam jumlah banyak. Misalkan, ditabur "polybag" dan diaduk-aduk. Dalam waktu seminggu, cairan itu akan menjadi pupuk untuk disemprotkan.

B.    Keunggulan M-BIO
1.    Pembuatannya lebih cepat dan singkat.
2.    Hasil fermentasi dari bahan organik ini (asam amino, asam laktat, gula, alkohol, vitamin, protein, dan asam lainnya) mudah diserap oleh tanaman.
3.    Kandungan nutrisinya lebih tinggi dari pada kompos
4.    Tidak meninggalkan residu negatif seperti gas dan panas, sedangkan dalam pembuatan kompos akan dilepaskan panas dan bau (gas)

C.    Peranan dan Fungsi Mikroba M-BIO
1.    Mampu mencegah terjadinya proses pembusukan semua bahan organik,
2.    Melarutkan senyawa anorganik (P, Ca, Mg, dll) & senyawa organik ( gula, asam amino, dan alkohol).
3.    Membentuk antioksidan ( mencegah O2 yang berikatan dengan penyakit tertentu dari tanaman, hewan ataupun manusia).
4.    Membentuk Zat Perangsang Tumbuh (ZPT) yang digunakan untuk pertumbuhan tanaman ( vegetatif dan generatif ).
5.    Meningkatkan kesehatan tanaman dan mengurangi atau menghilangkan bau busuk seperti amonia, H2S dan beberapa senyawa karbon serta gas-gas yang berbahaya yang dihasilkan oleh mikroba yang merugikan.

D.    Berbagai Bidang Aplikasi M-BIO
Bidang Pertanian dan Perkebunan
1.    Mempercepat penguraian bahan organik secara fermentasi yang menguntungkan.
2.    Meningkatkan hasil tanaman dan merangsang pembuahan dan mencegah bunga dan buah rontok.
3.    Memperbaiki tanah yang rusak ( sifat biologi, kimia dan fisika tanah ) agar menjadi gembur kembali secara bertahap.
4.    Mengikat Nitrogen di udara dan menghasilkan hormon perangsang tumbuh.
5.    Melarutkan senyawa P yang tidak tersedia dalam tanah menjadi bentuk P ( Phosfat ) yang tersedia bagi tanaman.
6.    Mencegah serangan hama dan penyakit tanaman
7.    Menghasilkan senyawa-senyawa yang penting untuk pertumbuhan tanaman.
8.    Memperbaiki pertumbuhan vegetatif tanaman

Bidang Perikanan
1.    Merangsang pertumbuhan Phyto plankton dan Zoo plankton sebagai pakan alami udang dan ikan.
2.    Meningkatkan/mempertahankan kesuburan tanah dasar tambak/kolam & menyeimbangkan unsur hara.
3.    Mengurai sisa-sisa pakan berlebihan, kotoran udang dan ikan menjadi senyawa organik.
4.    Merangsang pertumbuhan, meningkatkan kesehatan serta produksi benih udang dan ikan.
5.    Menetralkan pH dan menstabilkan kualitas air.
6.    Meningkatkan konversi pakan.
7.    Menekan kematian benih udang dan ikan serta menekan aktifitas serangan mikroorganisme patogen.
8.    Membuat Pakan Ikan.
9.    Sebagai food supplement dan mineral supplement pada unggas, ternak dan ikan.

Bidang Perternakan
1.    Menyehatkan/ meningkatkan daya tahan ternak terhadap serangan penyakit.
2.    Menurunkan FCR (Food Cost Ratio) juga menurunkan crude protein sampai 2 % tanpa menurunkan produksi.
3.    Memberikan nilai efisiensi dalam pencernaan makanan, menyerap nutrisi lebih banyak dan efisien.
4.    Meningkatkan nafsu makan ternak, dan mempercepat pertumbuhan ternak.
5.    Membantu menguraikan struktur jaringan pakan yang sulit terurai.
6.    Menekan dan mengendalikan bau kandang /kotoran ternak dan bakteri-bakteri patogen.

Pengolahan Limbah
1.    Menjernihkan & meningkatkan kualitas air.
2.    Menghilangkan bau busuk pada WC.
3.    Menurunkan kadar Chlorida dan Sulfat.
4.    Menurunkan kandungan logam-logam berat.
5.    Menetralkan pH serta mempercepat dekomposisi.
6.    Pengolah limbah organik rumah tangga, industri dan TPA

Bidang Tambahan yang Sangat Menguntungkan
• Sebagai bahan pembuat telur asin yang efektif dan efisien.
• Untuk membuat VCO
• Untuk membuat tepung MOCAF
• Mengawetkan makanan sebelum dimasak
• Dapat menjadi pengganti fungsi Obat merah/betadin.
• Dll.

BAB III
PENUTUP

A.    Kesimpulan
M-BIO merupakan kultur campuran mikroba yang menguntungkan dengan paten CMF-21 diantaranya ; Bakteri Pelarut Fosfat, Lactobacillus sp, Yeast, dan Azospirillum sp.
Hanya memerlukan waktu sampai 7 (tujuh) hari maka bahan-bahan organik dapat difermentasikan secara sempurna sehingga menjadi PORASI (Pupuk Organik Cara Fermentasi) yang berkualitas.
Memiliki beberapa keunggulan dibanding kompos dan dapat dipergunakan di semua bidang pertanian, peternakan, industri, pengolahan limbah, dll.

REFERENSI

http://organikdunia.blogspot.com/
www.m-bio.4t.com
www.webwebweb.com

Read More

Cara menseleksi keberhasilan memasukkan DNA baru ke dalam plasmid, lengkap dengan prosedur perseleksian

Rekayasa genetika adalah suatu teknik bioteknologi yang digunakan untuk mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme lain untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan.
DNA Rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar memiliki sifat- sifat atau fungsi yang kita inginkan sehingga organisme penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan. Misalnya, kita membuat DNA rekombinan yang memiliki fungsi membuat insulin. DNA ini kemudian kita masukan ke dalam bakteri dengan harapan bakteri tersebut dapat menghasilkan insulin. DNA rekombinan dilakukan melalui penyisipan gen dengan plasmid sebagai vektornya/ “kendaraan pemindah”.
Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:
    §  Teknik mengisolasi DNA;
    §  Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease;
    §  Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase;
    §  Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor)
    §  Vektor berkembang dengan sisipan DNA yang direkayasa.
Dua komponen utama yang terlibat di dalam rekayasa genetika, yaitu plasmid dan enzim.
1)                  Plasmid
Plasmid adalah molekul DNA berantai rangkap dan berbentuk cincin. Plasmid ditemukan didalam sel bakteri dan dapat berbiak secara bebas, lepas dari kromosom induk. Dalam rekayasa genetika, plasmid berperan sebagai vektor (kendaraan) yang digunakan untuk mentransfer dan memperbanyak gen asing.
Keuntungan penggunaan plasmid adalah dapat di pindahkan dari satu sel ke sel yang lain, misalnya melalui cara transformasi. Ketika satu gen “asing” (biasanya diekstrak dari satu kromosom sel eukariotik) telah disisipkan ke dalam satu plasmid, ia akan bertindak seperti kendaraaan yang mengangkut gen ke dalam sel bakteri. Plasmid yang membawa gen tersebut siap di absorpsi dan di replikasikan oleh bakteri sehingga setiap anakan sel yang dihasilkan akan mewarisi gen- gen baru. Selanjutnya, setiap bakteri didalam kultur gen- gen akan menginstruksi, misalnya “hasilkan hormon insulin manusia”.
Adapun beberapa cara pemindahan DNA diantaranya adalah:
     §  Konjugasi: pemindahan DNA dalam sel bakteri melalui kontak fisik antar kedua sel.
     §  Transformasi: pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan sekitarnya.
     §  Transduksi: pemindahan DNA daribsatu sel ke sel lainnya melaui perantara

2)                  Enzim
Dalam rekayasa genetika dikenal dua macam bahan kimia yang berperan penting. Kedua macam bahan kimia tersebut adalah enzim pemutus (retriksi endonuklease) dan enzim perekat (ligase).
Enzim retriksi endonuklease merupakan enzim khusus dari bakteri yang berguna sebagai alat pertahanan tubuh. Misalnya untuk melawan DNA asing yang menyusup masuk, seperti yang berasal dari virus. Dalam dunia rekayasa genetika, enzim tersebut bertindak sebagai gunting biologi yang berfungsi untuk memotong/ menggunting rantai DNA pada tempat- tempat khusus. Enzim retriksi endonuklease memiliki dua keutamaan. Pertama, memiliki fungsi kerja spesifik. Dalam hal ini enzim mampu mengenal dan memotong urutan nukleotida tertentu pada DNA. Kedua, mampu menghasilkan potongan- potongan runcingketika memotong rantai ganda DNA. Fragmen- fragmen yang dihasilkannya adalah berupa ujung runcing (ujung lengket) yang terdiri atas untaian tunggal. Setiap ujung dari fragmen memiliki bagian yang menjorok dengan urutan basa yang dapat dikenali dan dipasangi oleh basa yang terletak di ujung untaian lainnya. Misalnya, ujung untaian tunggal dengan urutan basa AATT pada satu ujung dan TTAA pada ujung yang lain. Kedua fragmen tersebut dapat disambungkan sehingga membentuk satu untaian nukleotida lagi. Dalam hal ini, enzim ligase berfungsi untuk merekatkan dan mempersatukan fragmen- fragmen/ potongan- potongan DNA.

      Teknik Plasmid Rekayasa Genetika
Melalui teknk plasmid dalam rekayasa genetika, para ahli dibidang bioteknologi dapat mengembangkan tanaman transgenik yang resisten terhadap hama dan penyakit, adaptif kekeringan dan kondisi tanah yang tidak subur, hewan transgenik dan lain- lain.


Gambar. Rekayasa genetika dengan plasmid bakteri

Pengertian Teknologi DNA Rekombinan
Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.
Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1). Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl
Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.
Enzim Restriksi
Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C.  Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1.  Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K.
Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut.
DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi.
Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA. Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi.
Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I.  Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya.
Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika.
Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:
1.      mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA
2.      memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya
3.      menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Gambar 11.3 memperlihatkan beberapa enzim restriksi beserta tempat pengenalannya.
Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. Huruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri, dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama.
Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif.
Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Ligasi Molekul – molekul DNA
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut.  Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).
Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.
Transformasi Sel Inang
Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli.
Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag l. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5ºC. Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45ºC selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil.
Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidak-tidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan.
Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang teknik PCR dapat dilihat pada Bab XII. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (lihat Bab X). Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

Read More

Kultur Jaringan

      Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa.[1] Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya.[1] Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa.
      Bioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-19, pemuliaan tanaman untuk menghasilkan varietas-varietas baru di bidang pertanian, serta pemuliaan dan reproduksi hewan.[2] Di bidang medis, penerapan bioteknologi pada masa lalu dibuktikan antara lain dengan penemuan vaksin, antibiotik, dan insulin walaupun masih dalam jumlah yang terbatas akibat proses fermentasi yang tidak sempurna. Perubahan signifikan terjadi setelah penemuan bioreaktor oleh Louis Pasteur.[1] Dengan alat ini, produksi antibiotik maupun vaksin dapat dilakukan secara massal.

       Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain.[3]
        Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.
          Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.
Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:
1) Pembuatan media
2) Inisiasi
3) Sterilisasi
4) Multiplikasi
5) Pengakaran
6) Aklimatisasi
         Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.
       Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.
      Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.
      Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.
     Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
      Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.
        Keunggulan inilah yang menarik bagi produsen bibit untuk mulai mengembangkan usaha kultur jaringan ini. Saat ini sudah terdapat beberapa tanaman kehutanan yang dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan, antara lain adalah: jati, sengon, akasia, dll.
        Bibit hasil kultur jaringan yang ditanam di beberapa areal menunjukkan pertumbuhan yang baik, bahkan jati hasil kultur jaringan yang sering disebut dengan jati emas dapat dipanen dalam jangka waktu yang relatif lebih pendek dibandingkan dengan tanaman jati yang berasal dari benih generatif, terlepas dari kualitas kayunya yang belum teruji di Indonesia. Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan memperoleh hasil yang lebih cepat
       KULTUR jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas). Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dan
tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazim diperbanyak secara kultur jaringan adalah tanaman anggrek.

Read More

Kode Warna HTML 2

CODE COLOUR
000000	000033	000066	000099	0000CC	0000FF
003300	003333	003366	003399	0033CC	0033FF
006600	006633	006666	006699	0066CC	0066FF
009900	009933	009966	009999	0099CC	0099FF
00CC00	00CC33	00CC66	00CC99	00CCCC	00CCFF
00FF00	00FF33	00FF66	00FF99	00FFCC	00FFFF
330000	330033	330066	330099	3300CC	3300FF
333300	333333	333366	333399	3333CC	3333FF
336600	336633	336666	336699	3366CC	3366FF
339900	339933	339966	339999	3399CC	3399FF
33CC00	33CC33	33CC66	33CC99	33CCCC	33CCFF
33FF00	33FF33	33FF66	33FF99	33FFCC	33FFFF
660000	660033	660066	660099	6600CC	6600FF
663300	663333	663366	663399	6633CC	6633FF
666600	666633	666666	666699	6666CC	6666FF
669900	669933	669966	669999	6699CC	6699FF
66CC00	66CC33	66CC66	66CC99	66CCCC	66CCFF
66FF00	66FF33	66FF66	66FF99	66FFCC	66FFFF
990000	990033	990066	990099	9900CC	9900FF
993300	993333	993366	993399	9933CC	9933FF
996600	996633	996666	996699	9966CC	9966FF
999900	999933	999966	999999	9999CC	9999FF
99CC00	99CC33	99CC66	99CC99	99CCCC	99CCFF
99FF00	99FF33	99FF66	99FF99	99FFCC	99FFFF
CC0000	CC0033	CC0066	CC0099	CC00CC	CC00FF
CC3300	CC3333	CC3366	CC3399	CC33CC	CC33FF
CC6600	CC6633	CC6666	CC6699	CC66CC	CC66FF
CC9900	CC9933	CC9966	CC9999	CC99CC	CC99FF
CCCC00	CCCC33	CCCC66	CCCC99	CCCCCC	CCCCFF
CCFF00	CCFF33	CCFF66	CCFF99	CCFFCC	CCFFFF
FF0000	FF0033	FF0066	FF0099	FF00CC	FF00FF
FF3300	FF3333	FF3366	FF3399	FF33CC	FF33FF
FF6600	FF6633	FF6666	FF6699	FF66CC	FF66FF
FF9900	FF9933	FF9966	FF9999	FF99CC	FF99FF
FFCC00	FFCC33	FFCC66	FFCC99	FFCCCC	FFCCFF
FFFF00	FFFF33	FFFF66	FFFF99	FFFFCC	FFFFFF

BY : MOMORU
FF4848	FF68DD	FF62B0	FE67EB	E469FE	D568FD	9669FE
FF7575	FF79E1	FF73B9	FE67EB	E77AFE	D97BFD	A27AFE
FF8A8A	FF86E3	FF86C2	FE8BF0	EA8DFE	DD88FD	AD8BFE
FF9797	FF97E8	FF97CB	FE98F1	ED9EFE	E29BFD	B89AFE
FFA8A8	FFACEC	FFA8D3	FEA9F3	EFA9FE	E7A9FE	C4ABFE
FFBBBB	FFACEC	FFBBDD	FFBBF7	F2BCFE	EDBEFE	D0BCFE
FFCECE	FFC8F2	FFC8E3	FFCAF9	F5CAFF	F0CBFE	DDCEFF
FFDFDF	FFDFF8	FFDFEF	FFDBFB	F9D9FF	F4DCFE	E6DBFF
FFECEC	FFEEFB	FFECF5	FFEEFD	FDF2FF	FAECFF	F1ECFF
FFF2F2	FFFEFB	FFF9FC	FFF9FE	FFFDFF	FDF9FF	FBF9FF
800080	872187	9A03FE	892EE4	3923D6	2966B8	23819C
BF00BF	BC2EBC	A827FE	9B4EE9	6755E3	2F74D0	2897B7
DB00DB	D54FD5	B445FE	A55FEB	8678E9	4985D6	2FAACE
F900F9	DD75DD	BD5CFE	AE70ED	9588EC	6094DB	44B4D5
FF4AFF	DD75DD	C269FE	AE70ED	A095EE	7BA7E1	57BCD9
FF86FF	E697E6	CD85FE	C79BF2	B0A7F1	8EB4E6	7BCAE1
FFA4FF	EAA6EA	D698FE	CEA8F4	BCB4F3	A9C5EB	8CD1E6
FFBBFF	EEBBEE	DFB0FF	DBBFF7	CBC5F5	BAD0EF	A5DBEB
FFCEFF	F0C4F0	E8C6FF	E1CAF9	D7D1F8	CEDEF4	B8E2EF
FFDFFF	F4D2F4	EFD7FF	EDDFFB	E3E0FA	E0EAF8	C9EAF3
FFECFF	F4D2F4	F9EEFF	F5EEFD	EFEDFC	EAF1FB	DBF0F7
FFF9FF	FDF9FD	FEFDFF	FEFDFF	F7F5FE	F8FBFE	EAF7FB
5757FF	62A9FF	62D0FF	06DCFB	01FCEF	03EBA6	01F33E
6A6AFF	75B4FF	75D6FF	24E0FB	1FFEF3	03F3AB	0AFE47
7979FF	86BCFF	8ADCFF	3DE4FC	5FFEF7	33FDC0	4BFE78
8C8CFF	99C7FF	99E0FF	63E9FC	74FEF8	62FDCE	72FE95
9999FF	99C7FF	A8E4FF	75ECFD	92FEF9	7DFDD7	8BFEA8
AAAAFF	A8CFFF	BBEBFF	8CEFFD	A5FEFA	8FFEDD	A3FEBA
BBBBFF	BBDAFF	CEF0FF	ACF3FD	B5FFFC	A5FEE3	B5FFC8
CACAFF	D0E6FF	D9F3FF	C0F7FE	CEFFFD	BEFEEB	CAFFD8
E1E1FF	DBEBFF	ECFAFF	C0F7FE	E1FFFE	BDFFEA	EAFFEF
EEEEFF	ECF4FF	F9FDFF	E6FCFF	F2FFFE	CFFEF0	EAFFEF
F9F9FF	F9FCFF	FDFEFF	F9FEFF	FDFFFF	F7FFFD	F9FFFB
1FCB4A	59955C	48FB0D	2DC800	59DF00	9D9D00	B6BA18
27DE55	6CA870	79FC4E	32DF00	61F200	C8C800	CDD11B
4AE371	80B584	89FC63	36F200	66FF00	DFDF00	DFE32D
7CEB98	93BF96	99FD77	52FF20	95FF4F	FFFFAA	EDEF85
93EEAA	A6CAA9	AAFD8E	6FFF44	ABFF73	FFFF84	EEF093
A4F0B7	B4D1B6	BAFEA3	8FFF6F	C0FF97	FFFF99	F2F4B3
BDF4CB	C9DECB	CAFEB8	A5FF8A	D1FFB3	FFFFB5	F5F7C4
D6F8DE	DBEADC	DDFED1	B3FF99	DFFFCA	FFFFC8	F7F9D0
E3FBE9	E9F1EA	EAFEE2	D2FFC4	E8FFD9	FFFFD7	FAFBDF
E3FBE9	F3F8F4	F1FEED	E7FFDF	F2FFEA	FFFFE3	FCFCE9
FAFEFB	FBFDFB	FDFFFD	F5FFF2	FAFFF7	FFFFFD	FDFDF0
BABA21	C8B400	DFA800	DB9900	FFB428	FF9331	FF800D
E0E04E	D9C400	F9BB00	EAA400	FFBF48	FFA04A	FF9C42
E6E671	E6CE00	FFCB2F	FFB60B	FFC65B	FFAB60	FFAC62
EAEA8A	F7DE00	FFD34F	FFBE28	FFCE73	FFBB7D	FFBD82
EEEEA2	FFE920	FFDD75	FFC848	FFD586	FFC48E	FFC895
F1F1B1	FFF06A	FFE699	FFD062	FFDEA2	FFCFA4	FFCEA2
F4F4BF	FFF284	FFECB0	FFE099	FFE6B5	FFD9B7	FFD7B3
F7F7CE	FFF7B7	FFF1C6	FFEAB7	FFEAC4	FFE1C6	FFE2C8
F9F9DD	FFF9CE	FFF5D7	FFF2D2	FFF2D9	FFEBD9	FFE6D0
FBFBE8	FFFBDF	FFFAEA	FFF9EA	FFF7E6	FFF4EA	FFF1E6
FEFEFA	FFFEF7	FFFDF7	FFFDF9	FFFDF9	FFFEFD	FFF9F4
D1D17A	C0A545	C27E3A	C47557	B05F3C	C17753	B96F6F
D7D78A	CEB86C	C98A4B	CB876D	C06A45	C98767	C48484
DBDB97	D6C485	D19C67	D29680	C87C5B	D0977B	C88E8E
E1E1A8	DECF9C	DAAF85	DAA794	CF8D72	DAAC96	D1A0A0
E9E9BE	E3D6AA	DDB791	DFB4A4	D69E87	E0BBA9	D7ACAC
EEEECE	EADFBF	E4C6A7	E6C5B9	DEB19E	E8CCBF	DDB9B9
E9E9C0	EDE4C9	E9D0B6	EBD0C7	E4C0B1	ECD5CA	E6CCCC
EEEECE	EFE7CF	EEDCC8	F0DCD5	EACDC1	F0DDD5	ECD9D9
F1F1D6	F5EFE0	F2E4D5	F5E7E2	F0DDD5	F5E8E2	F3E7E7
F5F5E2	F9F5EC	F9F3EC	F9EFEC	F5E8E2	FAF2EF	F8F1F1
FDFDF9	FDFCF9	FCF9F5	FDFAF9	FDFAF9	FCF7F5	FDFBFB
F70000	B9264F	990099	74138C	0000CE	1F88A7	4A9586
FF2626	D73E68	B300B3	8D18AB	5B5BFF"	25A0C5	5EAE9E
FF5353	DD597D	CA00CA	A41CC6	7373FF	29AFD6	74BAAC
FF7373	E37795	D900D9	BA21E0	8282FF	4FBDDD	8DC7BB
FF8E8E	E994AB	FF2DFF	CB59E8	9191FF	67C7E2	A5D3CA
FFA4A4	EDA9BC	F206FF	CB59E8	A8A8FF	8ED6EA	C0E0DA
FFB5B5	F0B9C8	FF7DFF	D881ED	B7B7FF	A6DEEE	CFE7E2
FFC8C8	F4CAD6	FFA8FF	EFCDF8	C6C6FF	C0E7F3	DCEDEA
FFEAEA	F8DAE2	FFC4FF	EFCDF8	DBDBFF	D8F0F8	E7F3F1
FFEAEA	FAE7EC	FFE3FF	F8E9FC	EEEEFF	EFF9FC	F2F9F8
FFFDFD	FEFAFB	FFFDFF	FFFFFF	FDFDFF	FAFDFE	F7FBFA

Read More